在有机合成、天然产物、药物研发实验室里，柱层析是实验室化合物纯化的核心工艺，传统手动玻璃柱层析是无数科研人最熟悉的纯化手段，依靠重力自流、手动调配洗脱剂、守在柱旁分段接样，凭借低成本、易上手的优势被广泛使用。但存在耗时长、重复性差、人力成本高、梯度无法精准控制等短板。
但当实验室引入 SepaBean 系列中压制备色谱，不少长期做手动过柱的科研人员都会遇到同一个难题：手上成熟的 TLC、HPLC 分析数据该如何转化为仪器梯度？溶剂、预装柱、上样量、流速该如何匹配原有实验条件？样品前处理、梯度程序又有哪些专属操作细节？
本篇依托三泰科技真实客户分离应用案例，专为从未接触中压设备、长期依靠手动玻璃柱纯化的研究人员打造。系统梳理手动玻璃柱转 SepaBean 仪器全套实操逻辑，覆盖分析数据转化、耗材选型、样品前处理、方法搭建、避坑要点全流程，为零中压仪器使用经验的科研工作者提供一套可直接落地的标准化操作方案，实现一键平稳过渡自动化纯化。
操作步骤：
Step 1 系统开机
1、打开仪器电源(位于仪器后面面板上)，点击仪器侧边电源按钮，待屏幕显示仪器序列号“SPBXXXXXX”及子系统状态后仪器自检成功。
2、iPad连接仪器内置的路由器，默认名称为“SPBXXXXXX”，默认WIFI密码为“SepaBean”。
3、打开ChemBeanGo® App，选择仪器，输入用户名和密码进入首页。点击仪器设备模块即可进入仪器操控页面。
Step 2 样品准备
成分复杂、杂质多、浑浊的样品，务必提前完成预处理（过滤、萃取、除杂等），防止难洗脱物质污染检测器、堵塞管路与色谱柱。
高浓度、强吸附性样品，降低上样量，避免样品残留难以清洗。
样品溶解性好，易溶于洗脱能力弱的溶剂，优先选择液体上样模式；当样品溶解性不好，只能溶于强洗脱能力溶剂时，优先选择固体上样模式。
固体上样
将样品溶解在合适的溶剂中，然后吸附在固体吸附剂上，固体吸附剂包括硅藻土、硅胶或其他材料。旋蒸去除溶剂后，将吸附在固体吸附剂上的样品倒入iLOK空柱中，保证样品截面平整，在样品表面铺一层硅胶或石英砂、棉花覆盖。
液体上样
尽量选择洗脱能力弱的溶剂对样品进行溶解、稀释，并且稀释体积尽量小，控制在所使用分离柱的10%柱体积以内。例如使用正己烷/乙酸乙酯作为流动相进行分离，尽量选择正己烷去溶解、稀释样品，如果无法完全溶解可适当增加乙酸乙酯比例。
样品溶液需澄清透明，上样前建议使用滤膜过滤，减少固体颗粒进入系统。
Step 3系统确认
1、打开机器维护-紫外检测器界面，确认氘灯能量。如果能量异常，需要对流通池进行维护清洗；
200-400mm：Intensity minimum[%]≥65%；
400-800nm：Intensity minimum[%]≥50%；
2、多人交替使用仪器时，务必做好使用交接，说明上一组实验所用溶剂、样品及仪器状态。
操作前务必核查仪器管路内当前填充的流动相，当待切换的两种流动相互不溶解时，严禁直接切换，需依次使用乙醇等作为中间溶剂进行过渡清洗，防止两相分层，保障设备与分离体系稳定。
3、废液瓶摆放位置需低于仪器。
4、实验所用溶剂均需使用分析纯级别试剂。
5、盛放溶剂的容器加盖密封，防止溶剂挥发、吸水、混入灰尘杂质。
6、流动相添加酸、碱、缓冲盐使用
正相硅胶：能不加添加剂就不加；顶多极个别强碱样品加一点点三乙胺，严禁加水、酸、氨水、缓冲盐，硅胶柱不能遇水。
反相 C18/C18AQ：胺类拖尾→加甲酸/乙酸；强碱胺依旧拖尾→少量氨水；氨基酸、多组分保留不稳定→加挥发性铵盐缓冲。
Step 4 方法设置
1. 选择正相分离或者反相分离模式
正相模式
· 普通硅胶柱（SiO₂）：最通用，替代实验室自制 200-300 目手动硅胶柱。
适用：有机合成小分子、酯、酮、醚、卤代烃、弱极性天然产物、粗反应液等。
反相模式
· C18（十八烷基硅烷）：通用反相柱，实验室使用最多。
适用：水溶性药物、黄酮、多酚、多肽、抗生素、糖类、极性极大中间体等。
· C18（AQ）柱：可稳定运行 0%–100% 纯水，解决极性样品普通 C18 留不住、峰重叠问题。
适用：氨基酸、短肽、核苷、糖类、多酚、黄酮苷、有机酸、水溶性盐类中间体等。
点击仪器操控首页“新建任务”，可以开启正相分离或反相分离实验。
2. 输入样品信息
输入待分离化合物的项目编号，及其他化学信息。尽可能填写完整信息包括CAS号、化合物名称及结构式。
3. 输入TLC展开剂信息/HPLC信息设置
输入TLC展开剂信息
展开剂信息包括溶剂及对应的比例，换算成%输入。
注意：将洗脱能力强的溶剂作为展开剂B，例如当使用正己烷和乙酸乙酯作为展开剂时，展开剂A选正己烷，B选乙酸乙酯。
HPLC信息设置
分析柱：点击下拉菜单选择分析柱型号，目前系统默认的分析柱型号为HPLC C18。
溶剂： 系统默认溶剂A为水，溶剂B为甲醇。也可根据实际情况点击下拉菜单在溶剂列表中选择或添加其他溶剂。
4. 输入TLC板信息/HPLC信息设置
输入TLC板信息
根据化合物点板信息，准确输入TLC实验的目标产物以及杂质的Rf值，得到左侧模拟的TLC板图片，也可以点击“
”按钮，使用拍照或从相册中选择图片直接自动生成相应的Rf值。Rf值框后方红色选中代表为产品点，无色未选中代表为杂质点，不同的选择对自动生成的洗脱曲线有所区别（目前功能维护中）。输入Rf值则自动生成推荐方法，不输入则需手动设置。
HPLC信息设置
目标物保留时间：选填；填写保留时间时，按照算法1自动生成分离梯度；不填写保留时间时，按照算法2自动生成分离梯度。
如下图所示，Rt1表示在HPLC中第一个峰的出峰时间，Rt2表示第二个峰的出峰时间，以此类推。B%表示每一个峰出现时所对应的溶剂B的洗脱百分比。Area%代表分离获得的样品各自所对应的峰面积。
5. 分离参数设置：
1) 输入上样量：本次分离的样品量。
2) 输入样品总量：需要分离的样品总量（包含液体上样中的用到的溶剂或者固体上样中用到的硅胶）。
3) 软件会根据上样量自动推荐分离柱，也可手动选择所需分离柱（根据选择分离柱规格可自动推荐流速，也可进行更改。
举例：我司产品E-8101-0025，对应25g硅胶的玻璃柱。
对于分离度较差的样品，可以选择更细粒径、更大尺寸的色谱柱。例如E-8101-0025分不开，可以选择E-8101-0080或者选择SW-2103-0025进行实验优化。
4) 选择检测波长（默认254、280nm）。
254 nm通用首选，含苯环、共轭双键、羰基、芳杂环结构的有机中间体、原料药、天然产物，在 254 nm 下都会产生稳定紫外吸收，是日常 TLC、HPLC 最常用监测波长，绝大多数合成粗品直接选用该波长即可捕捉目标峰。
280 nm适合酚类、黄酮、多肽、芳香氨基酸等样品。
带发色团、本身有颜色的产物（醌类、染料、金属络合物、长共轭天然色素），设置 400~800 nm 可见光区间检测。
未知样品：开启全波段扫描功能若不清楚样品最大吸收波长、组分结构复杂、多组分紫外吸收差异大，无需反复试错单一波长，直接打开仪器全波段扫描功能。
5) 选择收集方式：仪器初次上手操作时，建议优先选用全收集模式开展实验。
6) 插入装有试管的试管架，并设置收集体积。（建议收集体积低于试管体积至少2mL）。
7) 设置开始收集的试管架及试管编号（也可不进行设置，默认起始试管为第一个试管）。
8) 选择洗脱剂：在各溶剂通道的下拉菜单中选择分离实验所需的溶剂。
9) 梯度设置：如果已输入完整TLC信息，则会推荐梯度。否则，用户需要自行编辑梯度。当然，系统推荐的梯度也可以自行修改。设置梯度前请确认“CV”或“时间”模式。
常规分析 型HPLC 色谱柱填料粒径多为 3 μm、5 μm，分离精细；而 SepaBean 中压制备配套 SepaFlash 色谱柱填料粒径均在 15 μm 及以上，绝对不能直接照搬 HPLC 洗脱梯度，需要将 HPLC 方法转化为中压制备方法。
核心优化思路为：梯度整体放缓 2~3 倍，原 HPLC 起始有机相比例下调 3%~8%，延缓弱杂质提前洗脱；终点极性可小幅提高 5% 左右，保证强吸附杂质完全冲净。增加前置平衡段，关键区间增设等度平台等。
例如：原 HPLC 条件（5μm C18）：水 / 乙腈 90:10→50:50，15 min 梯度
中压优化方案：
梯度拉长至原时长 3 倍柱体积；
起始水相提升至 95%，减弱初始洗脱强度；
终点极性可小幅提高 55% 左右，保证强吸附杂质完全冲净。
Step 5 分离准备
1. 清洗管路
默认主路清洗，若用户需要，也可以选择绕过分离柱进行旁路清洗。正相分离第一次清洗溶剂为洗脱能力强的溶剂，第二次清洗溶剂为洗脱能力弱的溶剂。反相分离第一次清洗溶剂为极性大的溶剂，第二次清洗溶剂为极性小的溶剂。
2. 安装分离柱并润柱
安装分离柱并以默认的比例进行润柱。点击润柱按钮，可编辑润柱溶剂、比例和CV值，点击“开始润柱”，显示润柱溶剂吸光度色谱图。
润柱确认：必须等待 UV 谱图基线平直无漂移、无杂峰毛刺，才能进行上样进样；若基线波动、持续飘移、频繁出现鬼峰，需要重复润柱流程，直至谱图完全稳定。
3. 上样
润柱完成后，液体上样用注射器直接进样，固体上样则需安装上样柱。
液体上样：将柱架上端鲁尔拧开，注射器直接进样。
固体上样：将柱架上端鲁尔拧开，将上样柱安装在柱架上端。
Step 6 分离运行
完成上样后，正常开始分离运行，可以控制分离过程，包括：修改梯度、归零、自动梯度优化、手动梯度优化、收集方式、切换试管、参数设置、上样等。
Step 7 分离结束
实验结束，根据软件提示，吹干分离柱（时间可编辑），并清洗干净管路确保没有样品残留。默认旁路清洗，不可跳过此功能。
Step 8 分离后系统确认
1、实验后务必检查仪器系统，保证无样品残留。一旦发现残留，选择可充分溶解样品的溶剂，全面冲洗整个管路系统。
2、打开机器维护-紫外检测器界面，确认氘灯能量。如果能量异常，需要拆卸流通池，对流通池进行超声彻底清洗。
3、实验结束后，及时清空废液瓶，避免废液污染设备。
Step 9 分离报告
在首页“任务轨迹”搜索对应的实验记录，可查看分离详情，包括任务信息、样品信息、图谱和梯度设置等。可将分离报告直接导出成图片保存至iPad相册，也可以提取或引用该条试验记录的分离方法等。
注意事项
1、紫外检测器为精密光学部件，避免强光直射、剧烈震动。
2、长期不使用仪器时，用乙醇等保护溶剂封存管路与检测器。
3、严禁将溶剂吸头长时浸泡在酸、碱、含盐体系中，防止盐分析出堵塞管路、腐蚀配件。
如有问题，请拨打电话400-662-9158
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